هدف قرار دادن سرطان توسط سلولهای T با مهندسی TCR به کارگردانی آنتی ژن 1 سرطان ریه Kita-Kyushu

سلولهای T- مهندسی ژن گیرنده سلول T (TCR) نوید را در درمان ملانوما و سارکوم سلول سینوویال نشان داده اند ، اما کاربرد آنها در سرطان های اپیتلیال محدود بوده است. شناسایی TCR های درمانی جدید برای هدف قرار دادن این تومورها برای توسعه درمان های جدید مهم است. در اینجا ، ما خصوصیات بالینی TCR را در مقابل آنتی ژن 1 سرطان ریه کیتا-کیوشو (KK-LC-1 ، رمزگذاری شده توسط CT83) ، یک آنتی ژن میکروب سرطان با بیان مکرر در بدخیمی های اپیتلیال انسانی از جمله سرطان معده ، سرطان پستان ، سرطان پستان ، توصیف می کنیم. و سرطان ریهسلولهای T با مهندسی ژن بیان کننده KK-LC-1 TCR (KK-LC-1 TCR-TS) به رسمیت شناختن خطوط تومور CT83 + در شرایط آزمایشگاهی و رگرسیون واسطه تومورهای CT83 + xenograft در مدل های ماوس نقص ایمنی نشان داد. مطالعات واکنش متقاطع بر اساس تعیین تجربی نقوش تشخیص برای اپی توپ هدف ، واکنش متقاطع در برابر سایر پروتئین های انسانی را نشان نمی دهد. مطالعات بیان ژن CT83 در 51 بافت غیر عصبی و 24 بافت عصبی بیان را منحصراً به سلولهای جوانه زدایی نشان داد. CT83 با این حال توسط طیف وسیعی از سرطانهای اپیتلیال بیان شد ، با بالاترین بیان در سرطان معده ذکر شده است. در مجموع ، این یافته ها از تحقیقات بیشتر و آزمایش بالینی KK-LC-1 TCR-TS برای سرطان معده و احتمالاً بدخیمی های دیگر پشتیبانی می کند.

معرفی

درمان سلولی با سلولهای T مهندسی ژن گیرنده آنتی ژن که گیرنده های آنتی ژن کیمریک (CAR) یا گیرنده های سلول T (TCR) را بیان می کنند ، یک روش امیدوارکننده برای درمان سرطان است. سلولهای T که CAR ها را بیان می کنند (CAR-TS) اثربخشی در درمان لوسمی و لنفوم نشان داده اند [1 ، 2]. سلولهای T که TCR ها را بیان می کنند (TCR-TS) فعالیت بالینی را در سارکوم و سلول سینوویال نشان داده اند [3]. با این حال ، موفقیت با این رویکرد در سرطانهای اپیتلیال محدود بوده است [4].

یکی از محدودیت ها شناسایی آنتی ژن های محدود به تومور و گیرنده هایی است که این آنتی ژن ها را هدف قرار می دهند [5]. آنتی ژن 1 سرطان ریه Kita-Kyushu (KK-LC-1 ، رمزگذاری شده توسط CT83) یک آنتی ژن میکروب سرطان (CG) است که گزارش شده است که در بافت های سالم بیان محدود و بیان مکرر در برخی از سرطانهای اپیتلیال از جمله سرطان ریه ، سرطان معده است، و سرطان پستان [6،7،8]. علاوه بر این ، این تنها عضو خانواده آن است ، بنابراین ممکن است بدون خطر واکنش متقابل درون خانواده مورد هدف قرار گیرد. از این رو ، به نظر می رسد KK-LC-1 یک هدف جذاب برای ژن درمانی گیرنده آنتی ژن است [4].

بیشتر ژنهای آنتی ژن CG به کروموزوم X نقشه می کشند ، و بیان توسط مکانیسم های اپی ژنتیکی تنظیم می شود که اغلب منجر به بیان ژن مختصات می شوند. CT83 در XQ23 واقع شده است ، متمایز از سایر آنتی ژن های CG از جمله اعضای خانواده Mage Gene و CTAG1A (همچنین به عنوان NY-ESO-1 نیز شناخته می شود) [9]. KK-LC-1 به عنوان یک آنتی ژن ایمونوتراپی بالقوه با توصیف هدف یک کلون سلول T واکنشی آدنوکارسینوما ریه شناخته شد [6].

ما یک گیرنده سلول T واکنشی KK-LC-1 (KK-LC-1 TCR) از لنفوسیت های تومور آلوده (TIL) بیمار مبتلا به سرطان دهانه رحم را که پاسخ تومور کاملی به TIL درمانی داشتند ، شناسایی کردیم [10]. در اینجا ما ارزیابی بالینی گیرنده را گزارش می کنیم ، از جمله هدف قرار دادن سلولهای تومور در شرایط آزمایشگاهی ، رگرسیون تومورهای زنوگرافت در داخل بدن ، مطالعات واکنش متقابل و ارزیابی بیان آنتی ژن توسط بافتهای سالم و تومورها. این یافته ها پایه و اساس یک کارآزمایی بالینی برای بیماران مبتلا به سرطانهای اپیتلیال متاستاتیک گسترده است.

نتایج

KK-LC-1 TCR KK-LC-1 را هدف قرار می دهد_52-60ارائه شده توسط مولکول HLA-A*01: 01 [10]. اتصال KK-LC-1 را پیش بینی کرد_52-60به سایر مولکول های HLA ضعیف تر بود (پرونده اضافی 1: جدول S1) [11]. ما آزمایش کردیم اگر سلولهای T انسان شخص ثالث که برای بیان KK-LC-1 TCR (KK-LC-1 TCR-TS) منتقل شده اند ، خطوط سلولی توموری را که بیان CT83 و HLA-A*01: 01 را در شرایط آزمایشگاهی تشخیص داده اند. در سنجش های کوکوری یک شبه ، KK-LC-1 TCR-TS از 2 اهدا کننده انتشار اینترفرون (IFN) -γ را در پاسخ به رده های سلولی نشان داد که آنتی ژن هدف و عنصر محدودیت HLA را بیان می کند ، که نشانگر شناخت این خطوط است (شکل 1A، پرونده اضافی 1: شکل S1). اینها شامل خطوط سلولی بدون کنترل 4156 (سرطان دهانه رحم) ، EKVX (سرطان ریه) و A375 (ملانوما) بود. تمام رده های سلولی آزمایش شده که هر دو آنتی ژن هدف و عنصر محدودیت را بیان کردند ، تشخیص داده شدند. در مقابل ، تمام خطوط سلولی که هم آنتی ژن هدف و هم عنصر محدودیت را بیان نکردند ، تشخیص داده نشد.

KK-LC-1 TCR-TS تشخیص تومور در شرایط آزمایشگاهی را نشان می دهد و واسطه رگرسیون تومور در داخل بدن است. سلولهای CD8+ T انسانی از هر یک از 2 اهدا کننده برای بیان KK-LC-1 TCR (KK-LC-1 TCR-TS) انتقال یافتند و یا از بین رفتند (UT-TS). تشخیص تومور در یک روش کوکور یک شبه با رده سلولی هدف نشان داده شده در محور X مورد آزمایش قرار گرفت. مقدار IFN-γ در مایع رویی کشت توسط ELISA تعیین شد. بیان CT83 و HLA-A*01: 01 توسط هر رده سلولی هدف در کلید زیر محور x نشان داده شده است. HLA-A*01: 01 خطوط سلولی انتقال یافته CT83+ و با γ-retrovirus برای بیان HLA-A*01: 01 انتقال یافتند."PMA/Iono" سلولهای T را نشان می دهد که با PMA و یونومایسین تحریک شده اند."سلولهای T به تنهایی" سلولهای T را نشان می دهد که بدون سلولهای هدف یا تحریک کشت داده می شوند. B KK-LC-1 TCR-TS یا سلولهای کنترل T نشان داده شده در افسانه به صورت داخل وریدی به موش NSG که دارای تومورهای زیر جلدی 4156 یا A375 (همانطور که در بالا هر نمودار نشان داده شده است) تجویز شد. اندازه گیری تومور سریال در نقاط زمانی نشان داده شده در محور X ترسیم شد. موشهای درمان نشده هیچ درمانی دریافت نکردند. UT-TS منتقل نشد. DMF-5 TCR-TS یک آنتی ژن بی ربط (آنتی ژن 1 مرتبط با ملانوما) را هدف قرار می دهد [12]. n = 10 موش در هر گروه. میله های خطا خطای استاندارد میانگین را نشان می دهد. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه انجام شد

برای ارزیابی اینکه آیا KK-LC-1 TCR-TS به صورت سیستماتیک می تواند واسطه پاسخ تومور در داخل بدن باشد ، ما از یک مدل زنوگرافت موش برای درمان تومورهای زیر جلدی ، 4156 یا A375 استفاده کردیم. یک تزریق داخل وریدی تک رگرسیون ناشی از KK-LC-1 TCR-TS از 4156 تومور (شکل 1B). در بالاترین دوز (10 10 6 سلول) تمام موشها رگرسیون کامل تومور را نشان دادند. تومورهای A375 ، که بیان ناهمگن CT83 را نشان می دهند (پرونده اضافی 1: شکل S2A و B) ، در نهایت عود شده و تومورهای مکرر بیان CT83 کم را نشان می دهند (پرونده اضافی 1: شکل S2C) ، که ممکن است در اواخر عود آنها نقش داشته باشد. با این وجود ، تمام موش ها با تومورهای 4156 یا A375 تحت درمان با حداقل 1x10^6 KK-LC-1 TCR-TS رگرسیون تومور را نشان دادند. این داده ها نشان می دهد که KK-LC-1 TCR-TS می تواند سلولهای تومور را در شرایط آزمایشگاهی هدف قرار دهد و می تواند واسطه رگرسیون تومورها در داخل بدن باشد.

ما بعد KK-LC-1 TCR-TS را برای واکنش متقابل در برابر اپی توپ های بالقوه سایر پروتئین های انسانی ارزیابی کردیم. برای تعیین کدام باقیمانده در KK-LC-1_52-60اپی توپ برای به رسمیت شناختن توسط KK-LC-1 TCR بسیار مهم بود ، ما اسکن آلانین و گلیسین KK-LC-1 را انجام دادیم_52-60پپتیدتعویض آلانین در موقعیت های 3 ، 4 ، 5 ، 6 و 9 و تعویض گلیسین در موقعیت های 2 ، 3 ، 5 ، 6 ، 7 و 9 باعث کاهش بیش از 75 ٪ در انتشار IFN-γ نسبت به پپتید نوع وحشی شدوادبر اساس این داده ها ، باقیمانده در موقعیت های 3 ، 5 ، 6 و 7 استنباط می شود که اساسی ترین باقیمانده های غیر لنگرگاه برای تشخیص TCR است (شکل 2A و B). از ابزار آنلاین ScanProsite برای جستجوی پروتئین های انسانی که این موقعیت ها را به اشتراک می گذارند استفاده شد (پرونده اضافی 1: جدول S2) [13]. علاوه بر این ، یک ابزار اصلی جستجوی تراز محلی (BLAST) 6 پپتید انسانی دیگر را با سطح بالایی از هویت توالی به KK-LC-1 شناسایی کرد_52-60(پرونده اضافی 1: جدول S2). KK-LC-1 TCR-TS برای به رسمیت شناختن 10 پپتید نامزد در یک روش کوکور آزمایش شد. تشخیص تشخیص داده نشد (شکل 2C). بنابراین ، KK-LC-1 TCR واکنش متقاطع قابل تشخیص در برابر پپتیدهای انسانی در شرایط آزمایشگاهی را نشان نمی دهد.

KK-LC-1 TCR-TS واکنش متقاطع با پپتیدهای حاصل از پروتئین های دیگر انسانی را نشان نداد. سنجش های تولید IFN-γ نشان داده شده توسط کوک فرهنگ KK-LC-1 TCR-TS با EBV-LCL های اتولوگ بار با 1 میکروگرم بر میلی لیتر از پپتید نشان داده شده است. پس از همبستگی یک شبه ، مایع رویی های کوکره پس از همبستگی یک شبه برداشت شدند. غلظت IFN-γ توسط ELISA تعیین شد. میله های خطا نشان دهنده SD از 2 تکرار فنی است. شرایط "بدون پپتید" سلولهای هدف بدون پپتید را داشت."PMA/Iono" سلولهای T را نشان می دهد که با PMA و یونومایسین تحریک شده اند."UT-TS" سلولهای کنترل کننده T از همان اهدا کننده به عنوان KK-LC-1 TCR-TS غیرقابل انتقال بودند. A برای راهنمایی آزمایش واکنش متقابل ، اسکن آلانین KK-LC-1_52-60انجام شد. باقیمانده آلانین برای باقیمانده بومی در هر موقعیت KK-LC-1 جایگزین شد_52-60وادB برای تعارف جایگزینی آلانین و ارزیابی تأثیر موقعیت 7 در تشخیص هدف ، اسکن گلیسین نیز انجام شد. پپتیدهای C به دست آمده از پروتئین های انسانی که هویت را در بقایای تماس استنباط شده توسط آزمایشات در (الف) و (ب) یا با جستجوی انفجار برای پپتیدهای نامزد که حداقل 5/9 باقیمانده (55 ٪ هویت) به اشتراک می گذارند ، برای KK مورد آزمایش قرار گرفتند.-lc-1 به رسمیت شناختن

هدف قرار دادن آنتی ژن که توسط بافتهای سالم با TCR-T درمانی بیان می شود می تواند منجر به سمیت شدید خود ایمنی شود [5]. برای تعیین اینکه آیا CT83 توسط بافت های سالم بیان شده است ، ما واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (qRT-PCR) را بر روی یک آرایه سفارشی cDNA از بافت های سالم انجام دادیم. از آنجا که سایر اعضای خانواده آنتی ژن CG در سطح پایین در مغز بیان شده اند ، ما طیف وسیعی از بافت های عصبی را در صفحه غربالگری قرار می دهیم [14]. بیان CT83 در نمونه های کنترل مثبت اپیدیدیمیس و بیضه ، که فاقد بیان HLA هستند ، تشخیص داده شد و بنابراین ، نمی توان توسط سلولهای T هدف قرار گرفت. CT83 به جز در سطح بسیار پایین در بافت های دیگر تشخیص داده نشد (< 2500 copies) in urinary bladder (Fig. 3a). To further interrogate healthy tissues for expression of CT83 , we queried the BioGPS database (Barcode on normal tissues dataset) (Fig. 3b) [15]. Expression of CT83 did not exceed a z-score of 5, the value that suggests expression in a given tissue, except in sperm and testis. CTAG1A , the gene that encodes Cancer/testis antigen 1, an antigen that has been targeted with TCR-Ts without reactivity against healthy tissues, displayed a similar patte of expression. Taken together, these data suggest that CT83 expression by healthy tissues is restricted to germ cells.

بیان CT83 در بافت سالم به سایتهای دارای مصونیت یا غیر حیاتی محدود است. cDNA از یک صفحه سفارشی از 51 بافت غیر عصبی و 24 بافت عصبی برای بیان CT83 و CTAG1A توسط qRT-PCR ارزیابی شد. cDNA از رده های سلولی سرطانی و سلولهای T انسانی به عنوان گروه کنترل قرار گرفتند. محور y تعداد کپی کل را نشان می دهد. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه انجام شد. B بیان بافت سالم CT83 و CTAG1A به عنوان یک نقشه گرما بر اساس داده های جمع آوری شده از میکروآرای u133plus2 Affymetrix در دسترس از طریق BioGPS قرار می گیرد. مقادیر نشان داده شده Z-Scores تولید شده توسط عملکرد بارکد بسته R "FRMA" است. Z-Scores بیشتر از 5 نشان دهنده بیان ژن در بافت است

KK-LC-1 expression has been reported in gastric cancer, triple negative breast cancer, and lung adenocarcinoma [6,7,8]. To investigate whether KK-LC-1 is expressed in other cancer types, we tested 57 cell lines from 10 different types of cancer for CT83 expression by qRT-PCR. Lung, breast, cervical, ovarian, melanoma, prostate, and leukemia cancer cell lines were found to express CT83 , albeit with varying levels and frequencies of expression (Fig. 4a). Bioinformatic analysis of The Cancer Genome Atlas (TCGA) Provisional data set accessed on the cBioPortal Cancer Genomics public database also indicated CT83 expression in a wide range of cancers, with more frequent expression (>20 ٪ تومورها) در سرطان بیضه ، آدنوکارسینوما ریه ، سرطان لوزالمعده ، سرطان سلول سنگفرشی ریه ، سرطان گردن رحم ، سرطان مثانه ، سرطان سر و گردن و سرطان پستان (شکل 4B). ما قبلاً بیان CT83 را در یک پاپیلومای انسانی انسانی (HPV) + سرطان دهانه رحم متاستاتیک مشاهده کردیم. بررسی یک بانک از نمونه های سرطان دهانه رحم متاستاتیک بیان در 6/21 (29 ٪) سرطان سلول سنگفرشی گردن رحم و 5/8 (63 ٪) آدنوکارسینومای دهانه رحم (شکل 4C). در سایر سرطان های HPV+ ، بیان در 1/8 سرطان مقعد ، سرطان 0/5 سر و گردن و سرطان واژن 0/2 مشاهده شد (شکل 4C). برای ارزیابی فراوانی سلولهای درون یک تومور که CT83 را بیان می کند ، ما RNA را در هیبریداسیون درجا با RNASCOPE در سرطانهای معده ، سرطانهای پستان و سرطانهای ریه انجام دادیم. بیشترین فرکانس سلولهای مثبت در سرطانهای معده رخ داده است ، از 13 نمونه آزمایش شده ، 9 برای بیان CT83 مثبت بودند (میانگین: 50 ٪ ، دامنه: 5 تا 90 ٪). سرطان پستان منفی سه گانه نیز فرکانسهای مختلفی از بیان داشت که 4/9 نمونه برای CT83 مثبت بود (شکل 4D و E). سرطان ریه سلول غیر کوچک و سرطان لوزالمعده نیز مورد بررسی قرار گرفت اما آنتی ژن را کمتر بیان کرد و بخش کمتری از سلولهای مثبت را نشان داد (دامنه: 0 تا 5 ٪). این داده ها حاکی از آن است که سرطان معده ممکن است یک بیماری مطلوب باشد که در آن می توان KK-LC-1 را هدف قرار داد و سایر سرطان ها ممکن است مناسب باشند اما در بیماران کمتری.

CT83 expression by cancer cell lines and tumors. a The frequency (% of tumors that express the antigen) of CT83 expression by different cancer types was assessed. Expression data are derived from TCGA Provisional dataset accessed through cBioportal. Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads (FPKM) values >0 مثبت تلقی شدند. تعداد نمونه ها در هر نوع سرطان در پرانتز نشان داده شده است. B پانلی از رده های سلولی سرطانی برای بیان CT83 توسط qRT-PCR ارزیابی شد. محور Y نسخه های CT83 را در هر 10 5 نسخه ACTB نشان می دهد. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه انجام شد. C فراوانی سرطانهای متاستاتیک HPV+ که CT83 را بیان می کند توسط qRT-PCR ارزیابی شد. تعداد نمونه ها در هر نوع سرطان در پرانتز نشان داده شده است. آزمایشات دو بار انجام شد. ناهمگونی داخل رحمی بیان CT83 توسط RNA ISH با استفاده از RNASCOPE مورد بررسی قرار گرفت. نوع تومور روی محور x نشان داده شده است. فراوانی سلولهای تومور CT83 + توسط یک آسیب شناس مستقل و کور به ثمر رسید. تصاویر نمونه از تومورهای CT83 + توسط RNASCOPE نشان داده شده است. بزرگنمایی 20 برابر است. هسته ها با DAPI (آبی) متضاد شدند

بحث

در اینجا ، ما توصیف یک TCR برای هدف قرار دادن سرطانها که بیانگر آنتی ژن ژرمن سرطان KK-LC-1 است. سلولهای T برای بیان این TCR به رسمیت شناخته شده از خطوط تومور KK-LC-1+ در شرایط آزمایشگاهی و رگرسیون واسطه تومورهای KK-LC-1 در داخل بدن نشان داده شده است. KK-LC-1 TCR-TS واکنش متقاطع در برابر پروتئین های انسانی که نقوش باقیمانده تماس را با هدف مورد نظر به اشتراک می گذارند ، نشان نداد. ژن رمزگذاری KK-LC-1 ، CT83 ، توسط بافتهای سالم انسان غیر از سلولهای جوانه ای بیان نشده است. با این حال ، توسط انواع متنوعی از سرطانهای اپیتلیال در فرکانسهای متغیر و با سطح بیان داخل رحمی ناهمگن بیان شد. بیان در سرطان معده بالاترین بود ، جایی که با استفاده از RNA در هیبریداسیون درجا (ISH) 9/13 نمونه مثبت و 5 بیان در حداقل 50 ٪ سلولهای تومور نشان داده شد.

سمیت خود ایمنی از واکنش متقاطع ناخواسته TCR-TS در برابر بافت های سالم مانع از توسعه روشهای درمانی TCR-T در غیر این صورت شده است [16،17،18]. KK-LC-1 TCR-TS واکنش متقاطع را در برابر اپی توپ های پروتئین انسانی که نقوش تشخیص مشترک یا هویت توالی قابل توجهی دارند ، نشان نداد. آزمایش واکنش متقاطع بر اساس اسکن آلانین و گلیسین برای شناسایی باقیمانده های تماس TCR ممکن است تمام پپتیدهای واکنشی متقاطع بالقوه را شناسایی نکند. اسکن کامل از تمام جایگزین های اسید آمینه در هر موقعیت ممکن است حساس تر باشد [19]. با وجود این ، احتمال واکنش متقاطع KK-LC-1 TCR در برابر پروتئین های انسانی نسبتاً کم است زیرا در معرض انتخاب تیمیک انسان قرار گرفت و مناطق تعیین کننده مکمل تغییر نکرد. سمیت شدید TCR-T با واسطه خود ایمنی همچنین ناشی از هدف قرار دادن آنتی ژن هایی است که توسط بافت های سالم بیان می شوند [12 ، 20]. به نظر نمی رسد که CT83 توسط بافتهای حیاتی انسان بیان شود ، زیرا در پانل 51 غیر عصبی (به جز سلولهای جوانه زنی) و 24 بافت عصبی توسط qRT-PCR تشخیص داده نشده است. توجه به این نکته حائز اهمیت است که به دلیل تفاوت در مولکولهای پیچیده سازگاری موش و عمده انسان ، در این مطالعه توسط مدلهای حیوانات ایمنی قابل ارزیابی نیست. علاوه بر این ، داده هایی که مدل های Xenograft ، مانند نمونه های شاغل در این کار ، می توانند پیش بینی اثربخشی درمانی در انسان را پیش بینی کنند. بنابراین ، یک کارآزمایی بالینی فاز I با تشدید دوز دقیق مورد نیاز خواهد بود.

به نظر می رسد KK-LC-1 یک آنتی ژن هدف جذاب برای TCR-T درمانی است زیرا اغلب توسط طیف وسیعی از سرطانهای اپیتلیال بیان می شود و توسط بافتهای سالم حیاتی بیان نمی شود. ISH ناهمگونی داخل جمعی بیان را نشان داد ، که با سایر اهداف آنتی ژن CG مشاهده شده است و ممکن است در انتخاب انواع سرطان و بیماران خاص برای معالجه با این روش مورد توجه مهمی باشد. سرطانهای معده معمولاً بیان CT83 را نشان می دهند ، و بخش زیادی از سلول آنتی ژن را در برخی از تومورها بیان می کند (5/9 تومورهای مورد بررسی حداقل 50 ٪ مثبت را نشان دادند). روی هم رفته ، این داده ها از ادامه مطالعه KK-LC-1 TCR-TS برای درمان سرطان معده و احتمالاً بدخیمی های اپیتلیال پشتیبانی می کنند.

مواد و روش ها

مراقبت از حیوانات و آزمایشات داخل بدن

پروتکل های تحقیقاتی حیوانات توسط کمیته مراقبت و مراقبت از حیوانات NIH تصویب شد. موش NSG (آزمایشگاه جکسون) در امکانات NIH قرار گرفتند. تومورها با تزریق زیر جلدی سلول های 1 × 10 7 4156 یا سلول های A375 4 × 10 6 ایجاد شدند. هفت روز پس از تزریق سلول تومور ، موش ها با یک دوز واحد سلولهایی که با تزریق ورید دم انجام می شوند ، تحت درمان قرار گرفتند. اندازه تومور با کالیپر اندازه گیری شد و به عنوان سطح تومور (میلی متر 2) گزارش شده است.

رده های سلولی

رده های سلولی تومور از ATCC و بخش NCI در مورد درمان سرطان و تشخیص مخزن تومور ، به جز 4156 ، 4050 و 3748 که در آزمایشگاه ما تولید شده است ، بدست آمد. رده های سلولی تومور در محیط کشت بر اساس RPMI 1640 ، IMDM یا DMEM (Thermo Fisher Scientific) با 10 ٪ سرم گاوی جنین (Hyclone) رشد داده شد. هویت رده سلولی توسط مورفولوژی ، بیان HPV E6 و E7 و بیان CT83 تأیید شد. تایپ کلاس I HLA توسط آزمایشگاه مرکز بالینی NIH HLA یا با بررسی سوابق در دسترس عمومی تعیین شد. تمام خطوط سلولی به طور مرتب برای مایکوپلاسما بررسی می شدند. 293-A*01: 01 خطوط سلولی با انتقال 293 سلول با رمزگذاری ویروس دوتایی HLA-A*01: 01 و CD34 کوتاه تولید شد. سلولهای انتقال یافته با جداسازی سلول بر اساس CD34 (Miltenyi Biotec) انتخاب شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی

برای ارزیابی بیان CT83 ، RNA از رده های سلولی سرطان و سرطانهای متاستاتیک HPV+ با استفاده از RNEasy Plus Micro Kit (Qiagen) استخراج شد. غلظت RNA و خلوص توسط اسپکتروفتومتر نانودروپ (ترمو فیشر علمی) مورد بررسی قرار گرفت. سپس 1 میکروگرم از RNA برای تولید cDNA با استفاده از QScript cDNA Supermix (Quanta Bio) استفاده شد. بیان ژنهای مورد علاقه توسط qRT-PCR با مجموعه های آغازگر/پروب Taqman (Thermo Fisher Scientific) برای ژن CT83 (HS02386421_G1) ، ژن CTAG1A/B (HS00265824_M1) و ژن Housekeping (HS999999999999999999999999999999999999سیستم Quantstudio 3 RT-PCR (زیست سیستم های کاربردی) طبق دستورالعمل استاندارد سازنده. پلاسمیدهای DNA رقیق شده سریال CT83 و ACTB برای تولید منحنی های استاندارد برای اندازه گیری تعداد کپی با استفاده از روشهای استاندارد استفاده شد. شرایط دوچرخه سواری حرارتی مورد استفاده به شرح زیر بود: 95 درجه سانتیگراد 7 دقیقه ؛95 درجه سانتیگراد 15 ثانیه ، 60 درجه سانتیگراد 30 S × 40 چرخه ؛4 درجه سانتیگراد. یک پروتکل دقیق برای qRT-PCR را می توان در پرونده اضافی 1 یافت.

انتقال ویروسی سلولهای T

سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) از داوطلبان انسان سالم جدا شده و با یک ناقل رتروویروسی که KK-LC-1 TCR را رمزگذاری می کند، انتقال داده شد [10]. به طور خلاصه، رده سلولی بسته بندی 293GP با پلاسمید مورد نظر (pMSGV1-TCR) و پلاسمید پاکت pRD114 با استفاده از Lipofectamine 2000 (تکنولوژی های زندگی) ترانسفکت شد. مایع رویی رتروویروسی 48 ساعت بعد برداشت شد و برای انتقال PBMC هایی که با 50 نانوگرم در میلی لیتر anti-CD3 (OKT3، Miltenyi Biotec) و 300 IU/ml rhIL-2 (پرومته) تحریک شده بودند، به مدت 2 روز قبل از انتقال رتروویروسی تحریک شده بودند، استفاده شد. راندمان انتقال با استفاده از آنالیز فلوسایتومتری با استفاده از آنتی بادی زنجیره TCRβ ضد موش تعیین شد. پروتکل های دقیق برای تولید سوپرناتانت رتروویروسی و انتقال رتروویروسی سلول های T را می توان در فایل اضافی 1 یافت.

فلوسیتومتری

آنتی بادی های کونژوگه فلورسنت از BD Biosciences (ضد انسان CD4-FITC، کلون SK3، ضد انسان CD8-PE-Cy7، کلون SK1)، Biolegend (ضد انسان CD3-BV421، کلون SK7) و eBioscience خریداری شدند. CD34-APC انسان، کلون 4H11؛ ضد موش TCRβ-chain-PE، کلون H57-597). فلوسیتومتری با Novocyte (Acea Biosciences) انجام شد و با استفاده از نرم افزار FlowJo (TreeStar Inc) آنالیز شد. در تمام آنالیزها، سلول های دوتایی و مرده با استفاده از پروپیدیوم یدید (سیگما آلدریچ) و پراکندگی به سمت جلو و کناری خارج شدند. قبل از بررسی جمعیت مورد نظر، سلول های CD3+ بسته شدند. این استراتژی دروازه در فایل اضافی 1 نشان داده شده است: شکل S3.

سنجش های ایمونولوژیک

در جستجوی سیلیکو

ابزار ScanProsite برای انجام جستجوی پپتیدهای انسانی که حاوی KK-LC-1 بالقوه هستند استفاده شد_52-60نقوش تشخیص TCR با اسکن آلانین و گلیسین شناسایی شده است. جستجوها با نقوش انجام شد که شامل مسابقات در موقعیت های 3، 5، 6 و 7 (X-X-D-X-N-L-A-X-X) بود.

پروتئین NCI BLAST برای شناسایی پپتیدهای غیر KK-LC-1 اضافی در ژنوم انسان با سطح بالایی از هویت توالی به KK-LC-1 استفاده شد._52-60. پپتیدهای بیشتر از 9 باقیمانده یا کمتر از 8 باقیمانده از مطالعه حذف شدند. همه پپتیدهای کاندید که حداقل 5/9 باقی مانده (55٪ هویت) به اشتراک گذاشته شده بودند برای تشخیص در شرایط آزمایشگاهی مورد آزمایش قرار گرفتند. پارامترهای جستجوی BLAST و ScanProsite همانطور که قبلاً توضیح داده شد تنظیم شدند [16].

هیبریداسیون درجا کروموژنیک (CISH)

تشخیص CT83 توسط CISH با کیت معرف 2. 5 LS-RED (RNASCOPE) با استفاده از سیستم Bond Rx (Leica Biosystems) برای هیبریداسیون پروب های خاص CT83 (RNASCOPE 2. 5 LS پروب- HS-CT83-O1) (ACD) به هدف انجام شد. mRNAHomo sapiens پپتیدیل پرولیل ایزومراز B (سیکلوفیلین B) (PPIB) به عنوان یک کنترل مثبت مورد استفاده قرار گرفت و از یک ژن باکتریایی (ردوکتاز دی هیدرودیپیکولات (DAPB)) به عنوان کنترل منفی استفاده شد. سرطان ریه سلول غیر کوچک انسان (از جمله آدنوکارسینوما ، سرطان سلول سنگفرشی و سلول بزرگ) و نمونه های سرطان پستان منفی سه گانه ارائه شده توسط شبکه تعاونی بافت انسانی که توسط موسسه ملی سرطان (NCI) تأمین می شود. سایر محققان ممکن است نمونه هایی از همان موضوعات دریافت کرده اند. نمونه آدنوکارسینوما معده انسان از برنامه انکولوژی جراحی NCI بدست آمد. رنگ آمیزی و تصویربرداری ISH توسط آزمایشگاه آسیب شناسی مولکولی آزمایشگاه ملی فردریک برای تحقیقات سرطان انجام شد. اسلایدها با استفاده از اسکنر Aperio Scanscope FL (Leica Biosystems) دیجیتالی شدند. بیان CT83 توسط یک آسیب شناس آناتومیک (LMR) بر اساس وجود سیگنال های هسته ای و سیتوپلاسمی در سلولهای تومور به صورت دستی اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل پیش بینی اتصال KK-LC-1_52-60به مولکول های MHC-I

پیش بینی های اتصال MHCI با استفاده از ابزار اجماع منبع تجزیه و تحلیل IEDB [11] انجام شد ، که ترکیبی از پیش بینی های A aka netMHC (4. 0) [21،22،23] ، SMM [24] و Coblib [25] است. از پارامترهای زیر استفاده شد: روش پیش بینی- IEDB توصیه شده 2. 19 ؛منابع MHC گونه- انسان ؛مجموعه مرجع آلل کلاس HLA [26].

تجزیه و تحلیل داده های بیان ژن از مخازن بیوانفورماتیک

از BioGP های پایگاه داده عمومی برای تجزیه و تحلیل بیان آنتی ژن در بافت طبیعی استفاده شد. بارکد در مجموعه داده های بافتهای طبیعی (میکروآرای u133plus2 Affymetrix) انتخاب شد و CT83 (Probeset: 1559258_A_AT) و CTAG1A (Probeset: 211674_X_AT) داده های بیان استخراج شد. برای CTAG1A ، پروب های متعدد در دسترس بود و یکی بر اساس کمترین سطح پس زمینه انتخاب شد. برای تجزیه و تحلیل بیان CT83 در سرطان به پایگاه داده Cbioportal دسترسی پیدا کرد. تمام داده های بیان از مجموعه داده موقت TCGA بدست آمد.

تحلیل آماری

آزمایشات آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 7 انجام شد.

در دسترس بودن داده ها و مواد

مجموعه داده های مورد استفاده و/یا تجزیه و تحلیل در طول مطالعه حاضر در این مطالعه منتشر شده گنجانده شده است یا در صورت درخواست معقول از نویسنده مربوطه در دسترس است.

مخفف

ابزار اصلی جستجوی تراز محلی

گیرنده های آنتی ژن کیمریک

خطوط سلولی لنفوبلاستوئید ویروس با ویروس اپشتین بار

روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم

هیبریداسیون درجا

آنتی ژن 1 سرطان ریه Kita-Kyushu

سلولهای تک هسته ای خون محیطی

فوربول 12-میریستی 13 استات

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی

اطلس ژنوم سرطان

گیرنده سلول T

منابع

Brudno JN ، Kochenderfer JN. درمان آنتی ژن کیمریک درمانی T سلولهای T برای لنفوم. Nat Rev Clin Oncol. 2018 ؛ 15: 31-46.

Salter AI ، Pont MJ ، Riddell Sr. سلولهای T اصلاح شده با آنتی ژن کیمریک: CD19 و جاده فراتر از آن. خون2018 ؛ 131: 2621 9.

Robbins PF ، Kassim SH ، Tran TLN ، Crystal JS ، Morgan RA ، Feldman SA ، et al. یک آزمایش آزمایشی با استفاده از لنفوسیت ها از نظر ژنتیکی با یک واکنش NY-ESO-1 مهندسی شده است. Clin Cancer Res Off J Ass Assoc Cancer Res. 2015 ؛ 21: 1019 27.

Hinrichs CS. مسیرهای مولکولی: شکستن سد سرطان اپیتلیال برای گیرنده آنتی ژن کیمریک و ژن گیرنده سلول T. Clin Cancer Res Off J Ass Assoc Cancer Res. 2016 ؛ 22: 1559-64.

Hinrichs CS ، Restifo NP. ارزیابی مجدد آنتی ژن های هدف برای درمان سلول T فرزند. Nat Biotechnol. 2013 ؛ 31: 999.

Fukuyama T ، Hanagiri T ، Takenoyama M ، Ichiki Y ، Mizukami M ، So T ، et al. شناسایی یک ژن جدید سرطان/ژرمن ، KK-LC-1 ، رمزگذاری یک آنتی ژن شناخته شده توسط CTL اتولوگ ناشی از آدنوکارسینوما ریه انسان. سرطان Res. 2006 ؛ 66: 4922-8.

Shida A ، Futawatari N ، Fukuyama T ، Ichiki Y ، Takahashi Y ، Nishi Y ، et al. بیان مکرر آنتی ژن ریه کیتا-کیوشو آنتی ژن 1 (KK-LC-1) در سرطان معده. ضد سرطان2015 ؛ 35: 3575-9.

Paret C ، Simon P ، Vormbrock K ، Bender C ، Kolsch A ، Breitkreuz A ، et al. CXORF61 یک هدف برای ایمونوتراپی مبتنی بر سلول T از سرطان پستان سه گانه منفی است. Oncotarget. 2015 ؛ 6: 25356-67.

O'Leary NA ، Wright MW ، Brister Jr ، Ciufo S ، Haddad D ، McVeigh R ، et al. پایگاه داده دنباله مرجع (RefSeq) در NCBI: وضعیت فعلی ، گسترش طبقه بندی و حاشیه نویسی عملکردی. اسیدهای نوکلئیک Res. 2016 ؛ 44: D733-45.

Stevanovic S ، Pasetto A ، Helman SR ، Gartner JJ ، Prickett TD ، Howie B ، et al. چشم انداز آنتی ژن های تومور ایمنی در سیستم ایمنی درمانی موفق سرطان اپیتلیال ناشی از ویروسی. علوم پایه. 2017 ؛ 356: 200-5.

Kim Y ، Ponmarenko J ، Zhu Z ، Tamang D ، Wang P ، Greenbaum J ، et al. منبع تجزیه و تحلیل پایگاه داده اپی توپ ایمنی. اسیدهای نوکلئیک Res. 2012 ؛ 40: W525-30.

جانسون LA ، مورگان RA ، دادلی ME ، کاسارد L ، یانگ JC ، هیوز MS ، و همکاران. ژن درمانی با گیرنده های سلول T انسان و موش واسطه رگرسیون سرطان است و بافتهای طبیعی بیان آنتی ژن شناختی را هدف قرار می دهد. خون2009 ؛ 114: 535-46.

De Castro E ، Sigrist CJA ، Gattiker A ، Bulliard V ، Langendijk-Genevaux PS ، Gasteiger E ، et al. ScanProsite: تشخیص مسابقات امضاء PROSITE و باقیمانده های عملکردی و ساختاری مرتبط با پرول در پروتئین ها. اسیدهای نوکلئیک Res. 2006 ؛ 34: W362-5.

Chen Y-T ، Scanlan MJ ، Venditti CA ، Chua R ، Theiler G ، Stevenson BJ ، et al. شناسایی ژنهای سرطان/آنتی ژن با آن با توالی امضای موازی. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 ؛ 102: 7940-5.

McCall MN ، Uppal K ، Jaffee HA ، Zilliox MJ ، Irizarry RA. بارکد بیان ژن: استفاده از مخازن داده های عمومی برای شروع فهرست بندی رونوشت های انسانی و موش. اسیدهای نوکلئیک Res. 2011 ؛ 39: D1011-5.

Cameron BJ ، Gerry AB ، Dukes J ، Harper JV ، Kaan V ، Bianchi FC ، et al. شناسایی یک پپتید HLA-A1 مشتق از تیتین به عنوان یک هدف واکنشی متقابل برای سلولهای T مهندسی شده Mage A3. Sci Transl Med. 2013 ؛ 5: 197RA103.

Linette GP ، Stadtmauer EA ، Maus MV ، Rapoport AP ، Levine BL ، Emery L ، et al. سمیت قلبی عروقی و تیتین واکنش متقابل سلولهای T با افزایش میل در میلوما و ملانوما. خون2013 ؛ 122: 863-71.

Morgan RA ، Chiasamy N ، Abate-Daga D ، Gros A ، Robbins PF ، Zheng Z ، et al. رگرسیون سرطان و سمیت عصبی به دنبال ژن درمانی ضد ماگ-A3 TCR. J Immunother Hagerstown MD 1997. 2013 ؛ 36: 133-51.

Border EC ، Sanderson JP ، Weissensteiner T ، Gerry AB ، Pumphrey NJ. گیرنده های سلول T تقویت شده با هم برای هدف قرار دادن سلول T فرزند. Oncoimmunology. 2019 ؛ 8: E1532759.

Parkhurst MR ، Yang JC ، Langan RC ، Dudley ME ، Nathan D-An ، Feldman SA ، et al. سلولهای T هدف قرار دادن آنتی ژن کارسینومبرئونیک می توانند واسطه رگرسیون سرطان کولورکتال متاستاتیک باشند اما کولیت زودگذر را القا می کنند. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 2011 ؛ 19: 620-6.

Nielsen M ، Lundegaard C ، Woing P ، Lauemoller SL ، Lamberth K ، Buus S ، et al. پیش بینی قابل اعتماد اپی توپ های سلول T با استفاده از شبکه های عصبی با بازنمایی توالی جدید. پروتئین SCI PURT PROTEIN SOC. 2003 ؛ 12: 1007 17.

Lundegaard C ، Lamberth K ، Hadahl M ، Buus S ، Lund O ، Nielsen M. NetMHC-3. 0: پیش بینی های دقیق وب در دسترس از وابستگی های انسانی ، موش و میمون MHC کلاس I برای پپتیدهای طول 8-11. اسیدهای نوکلئیک Res. 2008 ؛ 36: W509 12.

Andreatta M ، Nielsen M. تراز دنباله ای را با استفاده از شبکه های عصبی مصنوعی: کاربرد در سیستم MHC کلاس I. Bioinforma oxf Engl. 2016 ؛ 32: 511-7.

Peters B ، Sette A. تولید مدلهای کمی که ویژگی توالی فرآیندهای بیولوژیکی را با روش ماتریس تثبیت شده توصیف می کند. BMC Bioinformatics. 2005 ؛ 6: 132.

Sidney J ، Assarsson E ، Moore C ، Ngo S ، Pinilla C ، Sette A ، et al. نقوش اتصال پپتید کمی برای 19 مولکولهای کلاس I انسانی و موش MHC کلاس I با استفاده از کتابخانه های پپتید ترکیبی اسکن موقعیتی. Immunome Res. 2008 ؛ 4: 2 2.

Weiskopf D ، Angelo MA ، de Azeredo EL ، Sidney J ، Greenbaum JA ، Feando AN ، et al. تجزیه و تحلیل جامع از پاسخ های خاص ویروس دنگو از نقش محافظتی مرتبط با HLA برای سلولهای CD8+ T پشتیبانی می کند. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 ؛ 110: E2046-53.

سپاسگزاریها

نویسندگان می خواهند از Yong F. Li از شاخه جراحی ، NCI ، برای ارائه معرفهای اساسی برای تجزیه و تحلیل qRT-PCR تشکر کنند. نتایج تا حدودی بر اساس داده های تولید شده توسط شبکه تحقیقاتی TCGA است: http://cancergenome. nih. gov/.

منابع مالی

این تحقیق توسط برنامه تحقیقاتی Intramural NIH پشتیبانی شد. این پروژه به طور کامل یا جزئی با بودجه فدرال از موسسه ملی سرطان ، انستیتوی ملی بهداشت ، تحت قرارداد شماره HHSN261200800001E تأمین شده است. محتوای این انتشار لزوماً منعکس کننده نظرات یا سیاست های وزارت بهداشت و خدمات انسانی نیست ، و همچنین ذکر نام تجاری ، محصولات تجاری یا سازمان ها حاکی از تأیید دولت ایالات متحده نیست.

اطلاعات نویسنده

نویسندگان و وابستگی ها

شعبه پیوند آزمایشی و ایمونولوژی ، انستیتوی ملی سرطان ، 10 مرکز درایو ، اتاق 4B04 ، بتسدا ، MD ، 20892 ، ایالات متحده

Bridget Marcinkowski ، Sanja Stevanović ، Sarah R. Helman ، Scott M. Norberg ، Carylinda Sea ، Benjamin Jin ، Nikolaos Gkitsas ، Tejas Kadakia & Christian S. Hinrichs

آزمایشگاه آسیب شناسی و بافت شناسی ، آزمایشگاه ملی فردریک برای تحقیقات سرطان ، فردریک ، دکتر ، 21702 ، ایالات متحده

برنامه انکولوژی جراحی ، انستیتوی ملی سرطان ، بتسدا ، دکتر ، 20892 ، ایالات متحده

دانشکده پزشکی جان هاپکینز ، بالتیمور ، دکتر ، 21205 ، ایالات متحده

1. Bridget Marcinkowski

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

همچنین می توانید این نویسنده را در PubMed Google Scholar جستجو کنید

مشارکت

SS ، BM و CSH این مطالعه را طراحی و توسعه داده اند. SS ، SH ، CS ، BJ ، AW ، NG و BM آزمایشات را انجام دادند. SS ، SH ، CSH ، LR ، SN و BM داده ها را تجزیه و تحلیل کردند و نتایج را تفسیر کردند. JD مواد ارائه داد. CSH ، BM و TK نسخه خطی را نوشتند. همه نویسندگان نسخه نهایی را خوانده و تصویب کردند.

نویسنده متناظر

اعلامیه های اخلاق

تأیید اخلاق و رضایت از شرکت

مطالعات حیوانات توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات NIH تأیید شد.

رضایت برای انتشار

منافع رقابتی

SS و CSH مخترعین در حق ثبت اختراع NIH مربوط به KK-LC-1 TCR هستند. CSH بودجه تحقیق را از طریق توافق نامه تحقیق و توسعه تعاونی NCI با KITE ، یک شرکت Gilead برای تحقیقات که مربوط به KK-LC-1 TCR است ، دریافت می کند.

اطلاعات اضافی

یادداشت ناشر

طبیعت Springer با توجه به ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های نهادی خنثی است.

پرونده اضافی

پرونده اضافی 1:

روشهای تکمیلی. جدول S1. اتصال KK-LC-152-60 به مولکولهای MHC-I پیش بینی شده است. جدول S2. پپتیدهای شناسایی شده توسط یک جستجوی در سیلیکو و برای واکنش متقابل آزمایش شدند. شکل S1. تعیین بیان HLA-A*01: 01 در رده های سلولی انتقال یافته توسط فلوسیتومتری جریان. شکل S2. سطح بیان CT83 در خطوط سلولی مورد استفاده برای آزمایش های داخل بدن متفاوت است. شکل S3. نمونه استراتژی دروازه برای فلوسیتومتری جریان.(Docx 15400 KB)

حقوق و مجوزها

دسترسی آزاد این مقاله با توجه به مجوز بین المللی Creative Commons Attribution 4. 0 (http://creativeecommons. org/licenses/by/4. 0/) توزیع می شود ، که امکان استفاده ، توزیع و بازتولید نامحدود در هر رسانه ای را فراهم می کند ، مشروط بر اینکه به شما ارائه می دهد ، مشروط بر اینکه به شما بدهد ، مشروط بر اینکه به شما ارائه شود ، مشروط بر اینکه به شما ارائه شود ، به شرط آنکه به شما ارائه شود ، به شرط آنکه به شما امکان پذیر باشد ، توزیع و تولید مثل و تولید مثل در هر رسانه ای ، به شرط آنکه به شما ارائه شود ، به شرط آنکه به شما امکان پذیر باشد ، توزیع و تولید مثل و تولید مثل نامحدود است. اعتبار مناسب برای نویسنده (های) اصلی و منبع ، پیوندی به مجوز Creative Commons ارائه می دهد و نشان می دهد که آیا تغییراتی ایجاد شده است. چشم پوشی از فداکاری دامنه عمومی Creative Commons (http://creativeecommons. org/publicdomain/zero/1. 0/) در مورد داده های موجود در این مقاله اعمال می شود ، مگر اینکه به طور دیگری بیان شده باشد.

در مورد این مقاله

این مقاله را ذکر کنید

Marcinkowski ، B. ، Stevanović ، S. ، Helman ، S. R. و همکارانهدف قرار دادن سرطان توسط سلولهای T با مهندسی ژن TCR که علیه آنتی ژن 1 سرطان ریه Kita-Kyushu است. ج. ایمونوتراپی سرطان 7 ، 229 (2019). https://doi. org/10. 1186/S40425-019-0678-x

دریافت شده: 05 مارس 2019

پذیرفته شده: 15 ژوئیه 2019

منتشر شده: 28 اوت 2019

این مقاله را به اشتراک بگذارید

هرکسی که لینک زیر را با آن به اشتراک بگذارید قادر به خواندن این محتوا خواهد بود: