استراز کوکائین باکتریایی: یک درمان مبتنی بر پروتئین برای مصرف بیش از حد کوکائین و اعتیاد

کوکائین بسیار اعتیاد آور است و هیچ داروی دارویی درمانی برای درمان سمیت حاد کوکائین یا سوء استفاده مزمن در دسترس نیست. تضاد یک مهار کننده مانند کوکائین با استفاده از یک مولکول کوچک دشوار است. روش جایگزین اصلاح خصوصیات فارماکوکینتیک کوکائین با توالی یا هیدرولیز کردن آن در سرم و محدود کردن دسترسی به سایتهای عمل آن است. ما از یک استراز باکتریایی (COCE) استفاده کردیم که به هیدرولیز کوکائین تکامل یافته و آن را به عنوان درمانی که به سرعت و به طور خاص کوکائین را از موضوع پاک می کند ، توسعه داده ایم. آنزیم بومی در دمای 37 درجه سانتیگراد ناپایدار بود ، بنابراین پتانسیل Coce را محدود می کند. روشهای محاسباتی نوآورانه مبتنی بر ساختار پروتئین به روشن شدن مکانیسم بی ثبات بودن آن کمک کرده است. روشهای مهندسی پروتئین جدید برای بهبود قابل توجهی پایداری آن در شرایط آزمایشگاهی و داخل بدن استفاده شد. این پیشرفت ها Coce را به عنوان یک درمانی قدرتمند و کارآمد برای درمان مسمومیت کوکائین و هدایت راه برای توسعه درمانی برای اعتیاد ، هدایت کرد.

کوکائین یک آلکالوئید تروپان است که توسط گیاه آمریکای جنوبی اریتروکسیلون کوکا تولید می شود. کوکائین با اتصال به تعداد بیشماری از سایت های بدن انسان ، اثرات آن را ایجاد می کند. اثرات روانی کوکائین از طریق اتصال به طور عمده به انتقال دهنده های انتقال دهنده عصبی مونوآمین در ترمینال عصب پیش سیناپسی و مسدود کردن آنها القا می شود و منجر به حضور طولانی مدت انتقال دهنده های عصبی در سیناپس می شود. حضور طولانی مدت دوپامین و سروتونین در سیناپس منجر به احساس سرخوشی و بهزیستی می شود [1-3]. محاصره مزمن و طولانی مدت حمل و نقل دوپامین می تواند منجر به تقویت خودآزمایی و بنابراین به اشکال مختلف اعتیاد شود [1]. اتصال به حمل و نقل های نورآدرنرژیک منجر به افزایش سیگنالینگ نورآدرنرژیک می شود ، که افزایش ضربان قلب (HR) ، فشار خون و انقباض عروق را که در مصرف کنندگان کوکائین دیده می شود ، تشکیل می دهد [1-4]. کوکائین همچنین کانال های سدیم قلبی و عصبی را که منجر به تغییر هدایت قلبی و اثرات بیهوشی آن می شود ، متصل می کند [5].

سوء استفاده از کوکائین یک مشکل جدی بهداشت عمومی است. بازدیدهای بخش اورژانس (ED) به دلیل سوء استفاده از کوکائین ، نمودارهای دیگر را در بین سایر داروها قرار می دهد. در سال 2008 ، کوکائین در کل 993،379 بازدید ED شامل یک داروی غیرقانونی (48. 5 ٪) در 482،188 درگیر شد. کوکائین به همراه الکل بیشترین مصرف مواد مخدر را به همراه دارد و دوباره تمام داروهای غیرقانونی دیگر را هدایت می کند. تخمین زده می شود که هنوز تقریباً 2 میلیون آمریکایی وجود دارد که خود گزارش کوکائین هستند ، اگرچه طبق مطالعات اخیر تعداد واقعی به احتمال زیاد بیشتر است [101]. در کل 15 ٪ آمریکایی ها کوکائین را امتحان کرده اند و 6 ٪ از سالمندان دبیرستانی از این دارو استفاده کرده اند [101].

علیرغم اینکه یک داروی بسیار اعتیاد آور و مورد آزار و اذیت است ، هیچ داروی مصوب FDA در ایالات متحده برای درمان سوء استفاده از کوکائین یا سمیت وجود ندارد. پزشکان ED بیماران مبتلا به علائم سمیت کوکائین را با عوامل استاندارد اورژانس که کنترل آریتمی ، تشنج و فشار خون بالا را کنترل می کنند ، اما با داروهایی که مستقیماً به میزان سمی کوکائین موجود در بیمار می پردازند ، درمان می کنند. علائم ارائه شده به دلیل مسمومیت کوکائین مشابه علائم مصرف بیش از حد آمفتامین است و پزشکان اتاق اورژانس قبل از استفاده از داروهایی که به سرعت سطح کوکائین را در این بیماران کاهش می دهند ، باید این معضل را حل کنند.

اکتشافات و رویکردهای مولکول کوچک

کشف یک پادزهر مولکول کوچک برای کوکائین از این واقعیت که ترکیباتی که با یک مهار کننده مانند کوکائین رقابت می کنند ، احتمالاً خود مهار کننده هستند. رویکردهای مربوط به سوء استفاده از کوکائین با آگونیست ها برای جایگزینی کوکائین [7] ، آنتاگونیست ها برای مسدود کردن کوکائین در محل عمل [8،9] و تعدیل کننده های کوکائین انجام شد ، با هدف تغییر اثرات کوکائین با عمل در سایت های غیر از حمل و نقل مونوامین[10-13]. داروهایی که مسیرهای GABAergic و دوپامینرژیک را هدف قرار می دهند ، برای درمان سوء استفاده از کوکائین به طور گسترده مورد آزمایش قرار می گیرند. داروهای GABAERGIC ، مانند باکلوفن ، توپیرامات و ویگاباترین ، که باعث افزایش فعالیت GABAergic مستقیم یا غیرمستقیم کاهش مصرف کوکائین و افزایش صفحه های ادرار منفی کوکائین می شوند [14-17]. مهار کننده انتشار GABA ، تیگابین ، همچنین به طرز شگفت آور کاهش مصرف کوکائین را کاهش می دهد [18]. Buproprion مهار کننده جذب دوپامین نتایج مختلط را در آزمایشات بالینی انسان نشان داد [19،20] ، در حالی که آنتاگونیست های گیرنده دوپامین D2 و گیرنده سروتونین 2A ریسپریدون و اولانزاپین نوید را در مصرف کنندگان کوکائین اسکیزوفرنی نشان داد اما در مصرف کنندگان طبیعی کوکائین [21-24]. آریپیپرازول ، یک آگونیست جزئی گیرنده دوپامین D2 و سروتونین 1A ، خودکشی مسدود شده در موش ها را مسدود کرد [25] و یک کارآزمایی بالینی فاز II در حال انجام است. Disulfiram ، یک عامل مورد استفاده برای درمان مزمن در مورد سوء مصرف الکل ، پتانسیل زیادی را در کاهش مصرف کوکائین در هنگام استفاده در دوزهای کم نشان داده است [26]. علیرغم این تلاشهای متنوع ، سایتهای بیشماری کوکائین باعث توسعه عوامل مولکول کوچک و سالم مبتنی بر فارماکودینامیکی به عنوان درمانی در برابر کوکائین شده است (جدول 1).

میز 1

جوانب مثبت و منفی رویکردهای مختلف درمانی برای کاهش سوء استفاده از کوکائین.

رویکردهای درمانی مبتنی بر پروتئین (بیولوژیک)

رویکرد مبتنی بر فارماکوکینتیک در هدف قرار دادن مولکول کوکائین به صورت محیطی و تغییر توزیع یا سرعت بخشیدن به ترخیص کالا از گمرک در سالهای اخیر باعث تحرک شده است. محققان با فاصله از کشف مولکول کوچک ، برای دستیابی به این هدف روی پروتئین درمانی متمرکز شده اند. درمان مبتنی بر پروتئین برای درمان بیماریها در سالهای اخیر کشش را به دست آورده است زیرا مزایای بسیاری برای روشهای درمانی مبتنی بر پروتئین وجود دارد. داروهای پروتئینی با عوارض جانبی محدود بسیار خاص هستند ، در نتیجه ایمن تر هستند و می توانند کارهای پیچیده ای را با راندمان بالا انجام دهند. رویکردهایی که از بیولوژیک پروتئین برای توالی کوکائین در سرم (آنتی بادی ها) یا کوکائین هیدرولیز در سرم استفاده می کنند قبل از رسیدن به محل عمل خود (آنزیم ها یا آنتی بادی های کاتالیزوری) وعده اولیه کافی برای ادامه تحقیقات در این خیابان هیجان انگیز نشان داده اند. عوامل بیولوژیکی پروتئین نمی توانند از سد خون و مغزی برای ورود به CNS عبور کنند ، در نتیجه اثرات خارج از هدف در CNS را کاهش می دهند ، که این یک نگرانی عمده برای درمان های مولکول کوچک است.

این که آیا استفاده از عوامل مولکول کوچک یا بیولوژیک پروتئین برای پاک کردن سریع سطح کوکائین که در بیماران مبتلا به مصرف بیش از حد کوکائین مشاهده می شود ، پزشکان ED ابتدا باید علت دقیق علائم را شناسایی کنند زیرا هم کوکائین و هم سایر محرک ها مانند آمفتامین ها مجموعه مشابهی از علائم را نشان می دهند. در زمان مجاز ، پزشکان ED می توانند چنین بیمارانی را با دوز تشخیصی کمتری از داروی کاهش دهنده کوکائین به عنوان ابزاری برای ارزیابی علت اصلی ارائه دهند. ما فرض می کنیم که یک داروی کاهش دهنده کوکائین یا پادزهر حتی با دوز پایین تر می تواند در یک بیمار مصرف بیش از حد روی کوکائین پاسخی ایجاد کند و از این طریق به پزشک اجازه می دهد علت علائم بیمار را درک کند.

آنتی بادی های درمانی و استراتژی های واکسیناسیون

ایمن سازی منفعل با آنتی بادی های مونوکلونال (MABS) در برابر کاهش مصرف کوکائین در موش صحرایی [27،28] و سمیت کوکائین مسدود شده در مدل های مصرف بیش از حد مسدود شده است [29]. ایمن سازی فعال با ترکیبات کوکائین منجر به ایجاد آنتی بادی های کوکائین قادر به توالی کوکائین در حاشیه شد. عناوین آنتی بادی برای مسدود کردن بازگرداندن ناشی از یک دوز واحد دارویی کافی بود ، اما این اثر محافظ با دوز کوکائین مکرر یا افزایش دوز برطرف شد [30،31]. موثرترین واکسن تا به امروز در برابر Norcocaine BSA- یا وبا و وبا با هم کنجده B (TA-CD) [27،28] بوده است و موفقیت آن در انتخاب عناوین آنتی بادی خوب منجر به شروع کارآزمایی های بالینی در انسان شده است [32،333]. گزارشات از آزمایشات بالینی حاکی از آن است که پاسخ آنتی بادی از این واکسن معمولاً 6 هفته به تأخیر می افتد ، پاسخ بسیار متغیر و سطح آنتی بادی تا 12 هفته کاهش یافته است [34،35]. mAb کاتالیزوری ، در موش های واکسینه شده با آنالوگ های حالت انتقال هیدرولیز کوکائین ، نه تنها مخرب کوکائین بلکه می تواند کوکائین را هیدرولیز کند. با این حال ، MABS برای بیش از 72 ساعت پس از تجویز از نظر درمانی فعال نبودند [36-38]. به غیر از TA-CD ، هیچ یک از بیولوژیک های مبتنی بر ایمونوتراپی وعده داده نشده است.

آنزیم های کوکائین هیدرولیز کننده

کار گسترده ای به توسعه آنزیم های سریعتر عمل رسیده است که می توانند با سرعت بیشتری کوکائین هیدرولیز کنند. آنزیم های هیدرولیز کننده کوکائین از مزیت مشخصی نسبت به استراتژی های ایمن سازی منفعل یا واکسن های کوکائین برخوردار هستند. میزان تفکیک آهسته موجود در مجتمع های آنتی ژ ن-آنتی بادی به ترتیب ثانیه تا دقیقه [39] ، میانگین کاهش سریع آنتی بادی های آزاد برای توالی کوکائین رایگان باقی مانده در سرم است. در حالی که ، آنزیم های بسیار کارآمد می توانند کوکائین را با سرعت بسیار بالا متصل و تخریب کنند ، در نتیجه مشکل سرعت آهسته را که با آنتی بادی ها دیده می شود از بین می برد. از آنجا که یک آنتی بادی ، به طور معمول یک قطعه FAB ، فقط می تواند یک مولکول از استوکیومتری کوکائین آنتی بادی ها را برای اطمینان از توقیف کامل داروها متصل کند. در شرایط مصرف بیش از حد ، غلظت آنتی بادی ها می تواند و به راحتی برطرف می شود ، در نتیجه منجر به درمان ناکارآمد می شود [30،31].

بیدیلچولین استراز

کوکائین در درجه اول ، هرچند بسیار آهسته ، توسط Butyrylcholinesterase (BCHE) در انسان هیدرولیز می شود و تحویل BCHE اگزوژن یک استراتژی خوب برای تسریع در متابولیسم آن به صورت سیستماتیک است [40]. یک نوع بسیار فعال BCHE ، که دارای 1730 برابر در راندمان کاتالیزوری بر روی نوع وحشی (WT) -BCHE در هیدرولیز کردن استریوایزومر فعال کوکائین ((-)-کوکائین) است ، نشان داده شد که به طور مؤثر از موش ها از دوزهای کشنده محافظت می کندکوکائین [41-43]. از آنجا که ژن و عملکرد BCHE با استیل کولین استراز نزدیک است ، هیدرولیز خارج از هدف ، به ویژه استیل کولین با وجود انواع BChe بسیار فعال برون زا ، نگران کننده است. برای دور زدن این مسئله ، یک رویکرد مدل سازی محاسباتی توسط Xue و همکاران برای پرداختن به مسئله ویژگی استفاده شد و آنها یک نوع پنتاموتانت BCHE را شناسایی کردند ، که استیل کولین را کمتر از WT-BCHE هیدرولیز می کند [42]. سایر موارد مربوط به درمان مبتنی بر BCHE اگزوژن شامل اختلالات عصبی احتمالی است ، از آنجا که بیان BCHE بالا و پروتئین در اختلالات عصبی [44] و بیماران آلزایمر [45] و حضور BCHE در پلاک های β-amyloid مشاهده می شود ، که نشان داده شده است. افزایش سمیت β-amyloid [46]. علاوه بر این ، روند بسیار پر زحمت تولید BCHE مانع اصلی ترجمه موفقیت آمیز این دارو به کلینیک ها است. تلاش هایی از قبیل بیان BCHE در شیر یا گیاهان بز تراریخته برخی از مسائل مربوط به تولید را کاهش داده است [47،48] ، با این حال ، هزینه و عدم وجود ایجاد حیوانات تراریخته و گیاهان مواردی است که باید قبل از آنکه BCHE به گزینه ای مناسب تبدیل شود. در همین حال ، گروه و همکاران ما روی یک آنزیم باکتریایی کوکائین استراز (COCE) متمرکز شده اند که می توانند این میدان را از موانع شناخته شده عبور دهند.

کوس باکتریایی

Coce جدا شده از سویه رودوکوک باکتری ها ، که در خاک ریزوسفر اطراف گیاهان کوکا رشد می کند ، سریعترین آنزیم طبیعی است که می تواند کوکائین هیدرولیز کند [49،50]. مشابه BCHE ، Coce کوکائین را در پیوند بنزوئیل استر بر روی کوکائین برای آزاد کردن اگزونین متیل استر و اسید بنزوئیک. ژن Coce کلون شده است و می توان آن را در سلولهای اشرشیاکلی در مقادیر زیادی بیان کرد. Coce در سیتوزول بیان شده و حاوی 574 باقیمانده است. ساختار کریستالی آن حل شده است. این یک پروتئین کروی حاوی سه حوزه است. متعلق به خانواده پروتئین های α/β هیدرولاز فوق العاده است و یکی از بزرگترین خانواده های پروتئینی است که حاوی بسیاری از لیپازها ، استرازها ، آمیدازها ، هیدرولازهای اپوکسید ، ده هالوژنازها و لیزهای هیدروکسییتریل است [50،51]. دامنه I دامنه حاوی تاشو α/β هیدرولاز است ، دامنه II عمدتا α- مارپیچ است که شامل هفت مارپیچ با مارپیچ 2 و 3 است که دارای یک ساختار خاردار است و یک ساختار لید مانند را بر روی سایت فعال تشکیل می دهد و دامنه III دارای یک توپولوژی ژله ای مانند رول است [50]

Coce بومی کوکائین را با 800 بار راندمان بیشتر از WT-BCHE جدا می کند. در یک مدل جوندگان برای سمیت حاد کوکائین ، Coce توانست بر خلاف هر یک از آنزیم های هیدرولیز کننده دیگر کوکائین که آزمایش شده است ، ده برابر تغییر در منحنی دوز و اثر کوکائین را القا کند [52]. تزریق داخل وریدی WT-COCE (1 میلی گرم) از 100 ٪ موش های دریافت کننده کوکائین داخل صفاقی (180 میلی گرم بر کیلوگرم) محافظت می کند اما تزریق داخل وریدی 13 میلی گرم از WT BCHE ، یک دوز معادل مولی ده برابر بالاتر از Coce نتوانست از موش های ناشی از کوکائین محافظت کندمرگ و میراما WT-Coce نشان داده شد که به سرعت در داخل بدن با نیمه عمر 12. 2 دقیقه پاک می شود [52]. ترخیص سریع نشان داده شد که به دلیل گرمازدایی بودن از آنجا که WT-Coce دارای نیمه عمر آزمایشگاهی تنها 0. 9 ± 11 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد بود [52،53].

این عدم ثبات در دمای فیزیولوژیکی یک سد راه برای توسعه Coce به درمانی برای سمیت کوکائین و پیشرفت بیشتر در ثبات آن است که برای نشانه اعتیاد ضروری است. ترموستاسیون پروتئین ها با استفاده از مهندسی پروتئین با موفقیت در بیوکاتالیست ها و آنزیم ها [54] و تکنیک هایی که از تکامل کارگردانی استفاده می کنند ، مانند B-Fit [55] و طراحی محاسباتی منطقی [56] استفاده شده است.

مهندسی پروتئین منطقی Coce

COCE در معرض شبیه سازی دینامیکی مولکولی قرار گرفت [53] ، جایی که شبیه سازی در 575 K انجام شد و مقادیر انحراف مربع ریشه مربع برای حرکت همه اتم ها محاسبه شد. حرکت با افزایش زمان به تدریج برای کل پروتئین اما به ویژه برای اتم های دامنه II ، که مقادیر انحراف ریشه مربع آن 9 بود ، بزرگتر بود. بنابراین ، مدل سازی محاسباتی پیش بینی کرد که دامنه II کمترین منطقه در Coce است و گمانه زنی می شود که اختلال در این منطقه در دماهای بالاتر منجر به از بین رفتن یکپارچگی ساختاری و فعالیت می شود. بنابراین ، دامنه II برای جهش هایی که پروتئین را در دماهای بالاتر تثبیت می کند ، هدف قرار گرفت. برای انتخاب جهش از دو روش استفاده شد: یکی تغییر در انرژی تعامل بین باقیمانده جهش یافته و بقیه پروتئین و دوم ، انرژی تاشو جهش یافته را بر اساس برنامه طراحی روزتا محاسبه کرد. جهش ها در صورت پیش بینی هر دو رویکرد معتبر در نظر گرفته می شدند [53].

، S177Q ، S179R ، R182K ، F189A ، F189L ، F189K ، A193D ، A194K ، W220A و T254R [57]. پیش بینی می شد که با افزایش تماس های داخل یا بین دامنه با دامنه I. ، ثبات دامنه II را بهبود بخشد. مکان های برخی از این جهش ها در شکل 1 نشان داده شده است.

Coce از سه حوزه ساختاری مجزا (دامنه I-III) تشکیل شده است. دامنه I حاوی کاتالیزوری S117 است و یک برابر α-/β- هیدرولاز متعارف را اتخاذ می کند. مکان جهش های نقطه پیش بینی شده با روش های محاسباتی و آزمایش شده برای فعالیت آزمایشگاهی به عنوان حوزه های تاریک نشان داده شده است. یک ترکیب اضافی DTT-Carbonate (DBC) در کلیه ساختارهایی که حاوی DTT هستند مشهود است.

مطالعه جهش های Coce قابل ترموست

تمام این جهش ها و برخی از ترکیبات آن از E. coli کلون شده ، بیان و خالص شدند. از تمام جهش های آزمایش شده ، فقط T172R ، G173Q و L169K در 37 درجه سانتیگراد در مقایسه با WT-Coce ثبات در آزمایشگاهی معنی داری نشان دادند. T172R نیمه عمر 78 دقیقه ای داشت (τ_1/2) در دمای 37 درجه سانتیگراد ، در حالی که G173Q و L169K به ترتیب نیمه عمر 75 و 403 دقیقه را به نمایش گذاشتند [53،57]. جهش G173Q هیچ گونه تأثیر مضر بر راندمان کاتالیزوری ، T172R و جهش دوتایی T172R-G173Q نشان نداد ، افزایش سه برابر در K_mدر مقایسه با WT-COCE ، در حالی که L169K هشت برابر افزایش در k را نشان داد_m[57]

ترکیب جهش ها به صورت جهش مضاعف T172R-G173Q (RQ-COCE) و L169K-G173Q (KQ-COCE) به طور هم افزایی ثبات Coce را با τ مشاهده شده افزایش داد_1/2از RQ-Coce 326 دقیقه و برای KQ-Coce 2. 9 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد (شکل 2A) [53،57،58]. متأسفانه ، ترکیب هر سه جهش منجر به آنزیمی بدون فعالیت قابل اندازه گیری شد و ترکیب دوتایی متناوب T172R-L169K از دست دادن 5. 6 برابر در راندمان کاتالیزوری در مقایسه با WT-COCE برخوردار بود [57].

(الف) برای محاسبه نیمه عمر آزمایشگاهی ، پوسیدگی در ظرفیت تبدیل کوکائین به اگزونین متیل استر و اسید بنزوئیک در 37 درجه سانتیگراد اندازه گیری شد. 50 نانوگرم در میلی لیتر WT-Coce ، T172R-Coce ، RQ-Coce ، L169K Coce ، KQ-Coce یا CCRQ-COCE در 37 درجه سانتیگراد و فعالیت محاسبه شده با گذشت زمان انکوبه شدند. τ_1/2مقادیر از منحنی های حاصل اندازه گیری شد.(ب) برای محاسبه نیمه عمر داخل بدن ، WT-COCE و جهش یافته ها از قبل به جوندگان تزریق شدند و در چند نقطه زمانی پس از مقاوم سازی یک دوز کشنده کوکائین (180 میلی گرم در کیلوگرم) داده شد و زمان لازم برای رسیدن به 50 ٪ بودمرگ و میر محاسبه و ترسیم شد. WT: نوع وحشی.

جهش های Coce که پایداری پیشرفته در 37 درجه سانتیگراد را نشان می دهند ، همچنین ترموست پذیری پیشرفته را نشان می دهد که توسط یک روش غیرفعال حرارتی و اندازه گیری دیچرویسم دایره ای تأیید می شود و پس از نظارت بر آشکار شدن پروتئین با استفاده از ترموفلوور. در یک روش غیرفعال سازی حرارتی ، WT-COCE و جهش های آن در دماهای مختلف قبل از اندازه گیری فعالیت انکوبه شدند. WT-COCE حساسیت قابل توجهی به دما نشان داد ، جایی که فعالیت آن به مدت 30 دقیقه در دمای 30-35 درجه سانتیگراد به طرز فجیعی کاهش می یابد. در حالی که ، L169K و RQ-COCE در دماهای بالاتر (40-45 درجه سانتیگراد) غیرفعال می شوند [53]. این داده ها به خوبی با اندازه گیری دوتایی دایره ای دناتوراسیون حرارتی ارتباط دارند ، که نشان دهنده افزایش 3. 1-3. 5 درجه سانتیگراد در دمای دناتوراسیون است (t_m) برای جهش های منفرد و افزایش 7. 1 درجه سانتیگراد برای RQ-COCE جهش یافته مضاعف [53]. روند غیرفعال سازی وابسته به دما از WT-Coce و جهش یافته با پروتئین وابسته به دما سازگار بود. دمای ذوب همچنین با استفاده از اتصال ANS (فلورسانس) با استفاده از یک خواننده ترموفلوور پیش بینی شد. T172R و G173Q هر کدام افزایش در دمای ذوب را نشان دادند (t_m) با 3 درجه سانتیگراد بیش از WT-Coce ، در حالی که RQ-Coce و L169K یک T را نشان دادند_mافزایش 6 درجه سانتیگراد [57]. حرف_mمقادیر WT-COCE ، RQ-COCE و KQ-COCE با کالری سنجی تیتراسیون ایزوترمال اندازه گیری شد و آنها به ترتیب 37. 62 ، 44. 04 و 46. 86 درجه سانتیگراد بودند ، به ترتیب [E Edwald ، R Sunahara ، داده های منتشر نشده].

تجزیه و تحلیل ساختاری انواع Coce قابل ترموست

تجزیه و تحلیل ساختاری WT-COCE و انواع ترموستبیلیزه شده در بالا به منظور ارائه برخی از بینش در مورد مکانیسم که این جهش ها باعث افزایش پایداری پروتئین می شوند ، انجام شد [57]. تفاوتهای اصلی در ساختارهای اشکال جهش یافته در تعامل های ایجاد شده توسط زنجیره های جانبی جهش یافته و در ترکیب حلقه H 2-H3 اتصال H2 (باقیمانده 159-175) و H3 (184-197) مارپیچ دامنه II ، مشاهده شد. که در دو یا سه ترکیب جایگزین متمایز وجود دارد. برای جهش T172R ، یک زنجیره آلکیل گسترده تر در موقعیت 172 و افزودن یک قطعه گوانیدینیوم ، تماس های ون در والس را با حلقه معطر F189 در H3 و پیوند هیدروژن بین قسمت گوانیدینیوم به اکسیژن ستون فقرات F189 معرفی می کند (شکل3C & D) [57].

ساختارهای کریستالی Coce نوع وحشی (A ، C& E) در مقایسه با T172R (B) ، G173Q (D) و L169K (F). به نظر می رسد که اثر تثبیت کننده جهش یافته ها ناشی از تعامل افزایش یافته بین H2 و H3 دامنه II یا بین زیر واحد ها (تعویض T172R) یا از تماس های متقابل اضافی (G173Q و L169K) است. زنجیره جانبی L169K دو سازه را نشان می دهد. توجه داشته باشید که L169 در ساختار Coce از نوع وحشی ضعیف است و زنجیره جانبی آن در معرض حلال قرار دارد که انتظار می رود بی ثبات کننده باشد. یک ترکیب اضافی DTT-Carbonate (DBC) در کلیه ساختارهایی که حاوی DTT هستند مشهود است.

در جهش G173Q ، زنجیره جانبی طولانی تر G173Q یک جیب کوچک پر از آب بین دامنه I و II در WT-Coce را اشغال می کند. نیتروژن آمید G173Q یک پیوند هیدروژن interdomain با کربونیل ستون فقرات P43 در دامنه I ، در توافق خوب با پیش بینی های شبیه سازی پویا مولکولی تشکیل می دهد. جالب توجه است ، پرولین مشابه در Acetobacter Turbidans Alpha-Adino Acid Ester Hydrolase [59] ، مشابه ترین ساختار در PDB ، همچنین یک پیوند هیدروژن بین دامنه با باقیمانده گلوتامین در دامنه II تشکیل می دهد. تماس های اضافی Van der Waals توسط زنجیره جانبی گلوتامین هم با زنجیره اصلی و هم با زنجیره جانبی Y44 و زنجیره های جانبی L77 ، F78 و I170 تشکیل می شود و این فعل و انفعالات با رویکردهای محاسباتی پیش بینی نشده است (شکل 3E و F) [[شکل 3E و F) [57]

در L169K ، اتم Nζ از L169K برای پیوند هیدروژن با مولکول های آب یا کرایوپ محافظت کننده ، گلیسرول در محل فعال در دسترس است. مدل سازی نشان می دهد که زنجیره جانبی طولانی تر لیزین می تواند به طور استریل در اتصال حلقه تروپان کوکائین تداخل داشته باشد ، که ممکن است K کمی بالاتر باشد_mمقدار به نمایش گذاشته شده توسط این جهش (شکل 3a & b) [57].

Coce کمر است

قطعه گوانیدینیوم بسته های T172R در برابر زنجیره جانبی I301 از زنجیره ای از تقارن کریستالوگرافی دو برابر Coce در شبکه کریستال. تجزیه و تحلیل بعدی از بسته بندی مشبک نشان داد که بسیاری از باقیمانده های هر سه حوزه Coce در تماس های نزدیک بین این دو زنجیره پروتئین دخیل هستند ، نشان می دهد که Coce در واقع یک همودیمر است. مطالعات کروماتوگرافی طرد اندازه نشان می دهد که Coce به عنوان یک قله واحد با وزن مولکولی ظاهری 140 کیلو دالتون برطرف می شود. سازگارترین با دیمر. پس از عملیات حرارتی در دمای 37 درجه سانتیگراد ، WT-COCE به عنوان یک موجودیت بزرگ مولکولی در حجم خالی ستون ، که فرض می کنیم یک شکل جمع شده از پروتئین است ، می شود. این کل فاقد فعالیت و WT-COCE به طور کامل در 1 ساعت از جوجه کشی در دمای 37 درجه سانتیگراد است ، در حالی که اشکال جهش یافته ترموست هشت برابر بیشتر برای جمع شدن طول می کشد [57]. ما فرض کردیم که مونومرهای COCE اتصال دهنده از طریق معرفی ارتباط (های) دی سولفید در موقعیت 4 (G4C) و موقعیت 10 (S10C) آنزیم را تثبیت کرده و در برابر تجمع محافظت می کنند [60]. جهش های G4C و S10C در ترکیب با جهش RQ (CCRQ-COCE) اثر تثبیت هم افزایی ایجاد کرد و یک آنزیمی را که تقریباً تمام فعالیت را پس از درمان در 37 درجه سانتیگراد به مدت 41 روز حفظ کرد ، به دست آورد ، که این یک بهبود 4700 برابر بیش از WT است.-COCE (شکل 2A).

Coce در مدل های جوندگان سمیت کوکائین

پس از ارزیابی داخل بدن از جهش های منفرد T172R ، G173Q و L169K ، و جهش های مضاعف RQ-CoCE و KQ-COCE ، مشاهده شد که بهبود در ثبات آنها در شرایط آزمایشگاهی در مدل های حیوانی برای سمیت کوکائین بسیار خوب ترجمه شده است. در این مدل ، جوندگان از قبل با WT-Coce یا جهش یافته بودند. در چندین نقطه تزریق پس از آنزیم ، دوز کشنده کوکائین تزریق شد و ظرفیت آنزیم برای محافظت در برابر مرگ و میر مورد بررسی قرار گرفت. زمان پیش درمانی که منجر به محافظت از 50 ٪ حیوانات شد ، به طور خودسرانه به عنوان نیمه عمر آنزیم در داخل بدن قرار گرفت. بر این اساس مشخص شد که WT-COCE ، T172R ، L169K ، RQ-COCE و KQ-COCE به ترتیب نیمه عمر داخل بدن 14 دقیقه ، 1. 8 ، 3. 3 ، 4. 5 و 8 ساعت داشتند (شکل 2B) [57،58]. KQ-COCE پیشرفت تقریباً 30 برابر نسبت به WT-COCE را نشان داد. طولانی ترین عمل CCRQ-Coce جهش یافته ما در بالاترین دوز آزمایش شده (32 میلی گرم در کیلوگرم) موش های محافظت شده از اثرات کشنده کوکائین بیش از 24 ساعت نیست [60].

در شرایط آزمایشگاهی و نیمه عمر داخل بدن KQ-Coce (به ترتیب 2. 9 روز در مقابل 8 ساعت) و CCRQ-COCE (41 روز در مقابل کمتر از 24 ساعت) به نظر می رسد که همبستگی و همچنین برای جهش های کوتاه تر Coce همبستگی ندارد. این مشاهدات که WT-Coce ، KQ-Coce و RQ-Coce دارای نیمه عمر سرم مشابه (2. 2 ساعت برای WT-COCE ، 2. 3 ساعت برای KQ-CoCE و 2. 4 ساعت برای RQ-COCE) با تجزیه و تحلیل وسترن بلات بودند که نشان دهنده نرخ حذف مشابه است، به شدت نشان می دهد که حذف داخل بدن ممکن است به دلیل عواملی فراتر از بی ثباتی حرارتی باشد [58،61].

تخریب پروتئاز و فیلتراسیون گلومرولی برخی از فرایندهایی هستند که می توانند نیمه عمر سرم یک بیولوژیک پروتئین را کوتاه کنند. علاوه بر این از اصلاحات مخفی از طریق ترکیب با ترکیب پلی اتیلن گلیکول (PEGYLATION) ، آلبومین یا سایر روشهای مهندسی پروتئین برای بهبود نیمه عمر داخل بدن Coce یا انواع آن با بهبود در نیمه عمر شرایط آزمایشگاهی در دسترس است [62]. در گزارش مقدماتی ، پارک و همکاران. نشان داد که Coce می تواند PEGYLATED باشد و هنوز هم فعالیت در شرایط آزمایشگاهی را حفظ می کند (~60 ٪ از آنزیم های غیرقانونی) و در داخل بدن. تجزیه و تحلیل MALDI-TOF از Coce Pegylated (توسط اتصال NHS) نشان داد که یک تا چهار زنجیره PEG برای هر مونومر Coce کونژوگه شده است. کارآیی PEGYLATION CONJUGATED COCE مبتنی بر سیستئین مبتنی بر Coce مشابه بود. PEG-Coce همچنین در برابر مرگ و میر ناشی از کوکائین به همان اندازه کارآمد WT-COCE در موش ها محافظت می کند [63]. تجزیه و تحلیل دوره زمانی داخل بدن بر روی اشکال pegylated این نسخه ها انجام نشده است. با گسترش این گزارش اولیه ، PEGYLATION در طولانی ترین ماندگار و پایدارترین شکل Coce ، CCRQ-Coce انجام شد. هنگامی که با یک PEG شاخه ای 40 کیلو دالتونی از طریق اتصال مالیمید ، PEG-CCRQ-Coce تمام فعالیت ها را در شرایط آزمایشگاهی و داخل بدن حفظ کرد [60]. ما فرض می کنیم که بهبود در حفظ فعالیت کامل آنزیمی PEG-CCRQ-COCE به دلیل بهبود قابل توجه ثبات CCRQ-Coce نسبت به WT-COCE بوده است.

در مطالعات مرگ و میر کوکائین ، PEG-CCRQ-COCE در بالاترین دوز مورد آزمایش (32 میلی گرم در کیلوگرم) 100 ٪ از حیوانات را برای بیش از 48 ساعت محافظت می کند ، یعنی پیش درمانی حیوانات با PEG-CCRQCoce در زمان 0 حیوانات محافظت شده از کشندهدوزهای کوکائین در T = 0 ، 24 و 48 ساعت پس از تزریق PEG-CCRQ-Coce تجویز می شود [60]. چالش های کوکائین با دوزهای تجویز شده 72 ساعت بعد از تزریق PEG-CCRQ-Coce کشنده به حدود 75 ٪ حیوانات کشنده بود. این دوز پروتئین PEGylated برای یک انسان معمولی با حجم خون تقریباً 5 لیتر با تقریباً 3. 0 میلی گرم در کیلوگرم مطابقت دارد.

Coce و انواع آن در مدل های خودآزمایی کوکائین

ارزیابی خودآزمایی مواد مخدر در جوندگان به ابزاری مهم برای ارزیابی تأثیر کاندیدای دارو در کاهش مصرف داروهای روانگردان در انسان تبدیل شده است [64]. موشها برای پاسخگویی به میزان 0. 1 میلی گرم در کیلوگرم/کوکائین تزریق تحت یک برنامه ثابت 5 تقویت کننده آموزش داده شدند. RQ-Coce اثر وابسته به دوز در تقویت پاسخ داشت. با افزایش دوز (0. 03-1. 0 میلی گرم در کیلوگرم RQ-COCE) ، پاسخ تقویت شده با کوکائین برای افزایش دوره زمانی کاملاً از بین رفت [65]. در یک تجزیه و تحلیل مشابه ، Brim et al. دریافت که KQ-COCE پاسخ به سطحی را که در هنگام جایگزین شدن نمک به جای کوکائین جایگزین می شود ، کاهش می دهد اگر آنزیم بلافاصله قبل از شروع جلسه داده شود (شکل 4) [58]. اگر آنزیم قبل از 1 ساعت قبل تجویز شود ، پاسخ نیمی از سطح دیده شده با شور بود. حیوانات تحت درمان 2 ساعت با kq-coce قبل از آن که دیگر پاسخ کاهش یافته را نشان ندادند. اینها به خوبی با دوره زمانی که در روش سمیت کوکائین و تجزیه و تحلیل وسترن بلات مشاهده می شود ، ارتباط دارد [58]. تأثیر مشابهی بر وابستگی به دوز نیز در آزمایشات واکسیناسیون فعال در انسان مشاهده می شود که افزایش قابل توجهی در مصرف کوکائین در بیماران هنگام گردش آنتی بادی ها کم است [34،66]. پیشرفت قابل توجهی در نیمه عمر داخل بدن از بهترین نامزد Coce ، همراه با افزایش راندمان کاتالیزوری آن ، باید این مسئله را دور بزند. برای این منظور ، PEG-CCRQ-COCE پاسخ کاملاً مهار کننده ای را که با دوز کوکائین به اندازه 1. 0 میلی گرم بر کیلوگرم/تزریق برای بیش از 48 ساعت حفظ می شود ، مهار می کند ، با آنتاگونیسم قابل توجهی از اثرات تقویت کننده کوکائین برای بیش از 96 ساعتپس از درمان [60،67].

سالین ، 1 میلی گرم RQ-Coce یا KQ-Coce به عنوان پیش درمانی 1 دقیقه قبل از جلسات خودآزمایی کوکائین داده شد. موشهای موجود در شرایط جایگزینی نمکی (نوار باز) در طول جلسه هیچ کوکائین از دماغ بینی دریافت نکردند.